2020年4月18日，医学类预印本杂志medRxiv在线发表了由北京市疾病预防控制中心王全意、首都医科大学附属北京佑安医院冯英梅为通讯作者，北京市疾病预防控制中心及首都医科大学公共卫生学院王小莉、首都医科大学附属北京佑安医院郭向华与科兴辛倩倩为第一作者的研究论文Neutralizing Antibodies Responses to SARS-CoV-2 in COVID-19 Inpatients and Convalescent Patients(《COVID-19住院病人和恢复期病人对SARS-CoV-2的中和抗体反应》)。分析不同发病时间和疾病严重程度的新型冠状病毒肺炎病人的抗体水平，可能有助于开发快速诊断试剂、疫苗、药物或其他治疗方法，对新冠疫情的长期控制和治疗具有重要意义。
 

       
       以下为论文官方翻译稿(图表见论文原文)

　　原文链接：https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2020.04.15.20065623v1

　　COVID-19住院病人和恢复期病人对SARS-CoV-2的中和抗体反应

　　王小莉1,2*，郭向华3*，辛倩倩4*，潘阳1,2，李晶4，初艳慧5，冯英梅3#，王全意1,2# 1 北京市疾病预防控制中心，北京，中国2 首都医科大学公共卫生学院，北京，中国3 首都医科大学附属北京佑安医院，北京，中国4 科兴控股生物技术有限公司，北京，中国5 北京市西城区疾病预防控制中心，北京，中国*三位作者同等贡献。 #通讯作者：冯英梅，首都医科大学附属北京佑安医院，北京，中国电子邮件：yingmeif13@sina.com;王全意，北京市疾病预防控制中心，北京，中国电子邮件：bjcdcxm@126.com。

　　摘要

　　背景：COVID-19作为一种全球流行疾病，目前还没有特定的抗病毒药物或疫苗，迫切需要探索来自不同临床症状病人的中和抗体水平。方法：本研究共收集70例COVID-19住院病人和恢复期病人的117份血样，采用改良的基于活病毒的细胞病变法测定中和抗体水平，并分析不同临床症状病人的中和抗体水平在不同发病时间的动态变化。

　　结果：发病后20天内的血清阳性率已经达到100.0%，并在41-53天仍保持在100.0%。GMT为1:163.7(95% CI, 128.5-208.6)，抗体水平在发病后31-40天最高，此后略有下降。8例代表性恢复期病人的抗体水平变化存在个体差异。在多元广义估计方程中，31-60和61-84岁病人的抗体水平显著高于16-30岁(β=1.0518，P=0.0152;β=1.3718，P=0.0020)。随着病情严重程度增加，抗体滴度也明显升高(β=0.4639，P=0.0227)。

　　结论：SARS-CoV-2中和抗体在疾病的早期就被检测到，而且恢复期病人有显著的中和抗体反应。抗体水平的变化因人而异，存在个体差异。

　　关键词：SARS-CoV-2;COVID-19;中和抗体;恢复期病人

　　背景

　　冠状病毒科是由大型、包膜、基因组为线性单股正链的RNA病毒组成的，可以感染多种动物和人类[1]。在过去的二十年里，全球共出现两次冠状病毒的流行。2003年，严重急性呼吸系统综合症冠状病毒(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus，SARS-CoV)首次出现，并在全球范围内爆发[2]。2012年又发生了中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus，MERS-CoV)的感染[3]。2019年12月，中国武汉出现了严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2，SARS-CoV-2)，并在全球迅速传播。世界卫生组织(World Health Organization，WHO)宣布2019年冠状病毒病(Coronavirus Disease 2019，COVID-19)已具有全球大流行特征。截至2020年4月12日，全球已有211个国家和地区报告了COVID-19，确诊病例总数高达1696588例，死亡人数为105952例[4]。此外，包括美国在内的许多国家和地区的确诊病例数仍在持续快速增长[5]。迄今为止，通过扩大检测、隔离病例、追踪接触者和社会管控等措施，中国的疫情已经得到了有效控制[6]。截至2020年4月12日，中国仅有1156例在治病人[7]。针对COVID-19，目前的治疗方法主要是支持性治疗和传统的抗病毒治疗，缺少针对性的抗病毒药物和疫苗[8]。

　　中和抗体在病毒清除中起着重要的作用，是治疗病毒性疾病的重要免疫物质。有研究显示，使用恢复期血浆可以有效治疗埃博拉病毒、SARS-CoV和H5N1禽流感等病人[9]。《中国-世界卫生组织新型冠状病毒肺炎联合考察报告》指出，从COVID-19恢复期病人中采集的血清可以完全中和分离病毒的细胞感染性[10]。此外，Shen等人[11]也发现，在输入含有中和抗体的恢复期血浆后，5例COVID-19危重症病人的临床症状得到有效改善。这些研究提示，输入恢复期血浆也可能有益于COVID-19病人的治疗。但是，恢复期病人的免疫持续时间和免疫水平变化仍有很大的不确定性。因此，分析不同发病时间和疾病严重程度的COVID-19病人的抗体水平，可能有助于开发快速诊断试剂、疫苗、药物或其他治疗方法，对COVID-19的长期控制和治疗具有重要意义。

　　本研究通过分析不同临床症状的COVID-19住院病人和恢复期病人，自发病以来不同时间中和抗体水平的动态变化，为科学界了解、检测和治疗COVID-19提供信息。

　　材料和方法

　　研究设计和研究对象

　　研究根据国家卫生健康委员会发布的《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第七版)》，定义COVID-19病例，并进行疾病严重程度的临床分型。研究中的70例COVID-19病人分别来自A医院和B医院，其中住院病人12例，恢复期病人58例。为了了解中和抗体产生的动力学，分别对39例、19例、8例和4例病人采集1个、2个、3个和4个时间点的血样，共纳入117份血样。研究方案经首都医科大学附属北京佑安医院医学伦理委员会审核通过(批准文号：LL-2020-041-K)。在试验前，每个病人都签署了书面知情同意书。

　　为了研究抗体滴度随时间变化情况，从70例病人中选择8例恢复期病人，其中4例有轻型症状，4例有普通型症状。分别有2例、2例和4例病人采集了2个、3个和4个时间点的血样。

　　临床指标

　　研究记录了病人的性别、年龄、病史、近几周在武汉的居住或旅行史等信息，测量了病人的体温、血压等人体特征指标，并测定了病人的不同类型白细胞、血小板、C反应蛋白等信息。

　　中和抗体评价

　　研究评价了血清阳性率和抗体的几何平均滴度(Geometric Mean Titer，GMT)。在第5天时，中和抗体滴度用Reed-Muench法计算。抗体滴度大于等于1:4表示血清阳性。为了计算GMT，抗体滴度<1:8，>1:512，>1:1024分别赋值为1:4、1:(512+512/2)和1:(1024+1024/2)。

　　研究采用改良的细胞病变法测定中和抗体。血样经过30分钟56°C的失活处理后，用细胞培养液按两倍进行系列稀释。稀释后的血清与100 CCID50病毒悬液按1:1的比例在96孔板中混合，在5% CO2和36.5℃培养箱中作用2小时。然后在血清-病毒混合液中，加入1-2 X104 Vero细胞，在5% CO2和36.5℃培养箱中进行5天的中和反应。期间，在显微镜下记录各孔的细胞病变效应(Cytopathic Effect，CPE)，能保护50%的血清孔不出现CPE的稀释倍数记为中和抗体滴度。

　　统计分析

　　连续变量采用平均值和标准差进行描述，分类变量采用例数和百分数描述。自发病以来第1次样本检测的天数采用中位数、最小值和最大值来描述。对数变换的中和抗体值采用Kruskal-Wallis秩和检验进行比较。分类资料的比较采用卡方检验或Fisher精确检验。抗体水平与潜在影响因素之间的关系，如性别、年龄、临床分型、自发病以来的天数，采用广义估计方程(Generalized Estimating Equations，GEE)进行估计，连接函数为logit。该模型考虑了病人重复测量之间的相关性。以双侧P<0.05为差异有统计学意义。所有分析采用SAS 9.4进行。

　　基金项目的作用

　　资助者没有参与研究设计、数据收集、数据分析、数据解释或文章撰写等。

　　结果

　　病人特征

　　本研究纳入70例新冠肺炎病人，其中58例病人已经恢复出院。病人平均年龄为45.1岁(范围为16.0-84.0岁)，女性占58.6%(表1)。居住或旅行去湖北武汉的病人有38例，占54.2%。有心血管疾病、糖尿病和高血压病史的病人分别为2例(2.8%)、5例(7.1%)和9例(12.9%)。根据疾病严重程度，无症状感染者有1例(1.4%)，临床症状为轻型、普通型和重型的病人分别有22例(31.4%)、43例(61.5%)和4例(5.7%)(住院病人1例，恢复期病人3例)。住院病人和恢复期病人的C反应蛋白分别为7.5和17.2mg/L。自发病以来，第1次样本检测的中位时间为33.0天(范围为10.0-53.0天)，恢复期病人的时间(35.0天)比住院病人(13.5天)更长。

　　抗体水平随发病时间的变化

　　在发病后的不同阶段，117份血样的血清阳性率一直维持在100.0%。GMT为1:163.7(95% CI，128.5-208.6)，其中52.1%(61/117)的血样中和抗体滴度在1:64至1:512之间(表2)。

　　我们分析了中和抗体水平随发病时间的变化(表2)，发现不同发病天数的中和抗体水平差异有统计学意义(P=0.0012)。GMT在发病后31-40天达到最高值(1:271.2，95% CI，175.8-418.5)，之后略有下降。单因素GEE分析表明，发病后31-40天的抗体水平明显高于其他阶段(表4)。但是，多因素GEE分析显示，31-40天的抗体水平仅仅高于10-20天(β= -0.6276，P=0.0201)。

　　在发病后不同阶段，中和抗体滴度的分布也存在差异(表2和图1)。中和抗体滴度小于1:64的比例随发病天数的增加而下降(Ptrend=0.0061)，在41-53天的比例最低(6.9%)。在发病后41-53天，抗体滴度在1:64至1:512之间的比例为65.5%，与其他阶段无显著差异(P=0.0990)。抗体滴度大于等于1:512的比例随发病天数的增加而增加(Ptrend=0.0227)，在31-40天达到最高(52.8%)。

　　恢复期病人抗体水平的时间变化

　　自发病以来，8例代表性恢复期病人的中和抗体检测时间范围为12.0-60.0天。在发病后12-25天，4例病人(c、d、e和f)的抗体滴度呈上升趋势，但是另外4例病人(a、b、g和h)的抗体滴度则呈下降趋势(图2)。在发病后26-60天，4例病人(a、b、c和 d)的抗体滴度显著增加，3例病人(e、f和h)则有所下降，另外1例病人(g)的抗体滴度仍然维持在1:128。值得注意的是，有1例病人(f)的抗体滴度从第20天的1:1536降至第43天的1:48。

　　抗体水平随疾病严重程度的变化

　　不同性别间的中和抗体水平相当，其中男性GMT为1:168.6(95% CI，101.2-280.9)，女性为1:185.6(95% CI，129.1-266.6)。在单因素和多因素GEE分析中，性别差异同样也无统计学意义(P=0.9426;P=0.8543)。61-84岁病人的GMT为1:220.1(95% CI，71.8-674.8)，高于16-30岁病人(1:71.0，95% CI，27.7-181.8)和31-60岁病人(1:200.6，95% CI，150.4-267.6)(P=0.0140)。在多因素GEE分析中，31-60岁和61-84岁病人的抗体水平显著高于16-30岁病人(β=1.0518，P=0.0152;β=1.3718，P=0.0020)。

　　无症状或轻型症状的病人抗体水平(GMT 1:141.9，95% CI，79.5-253.2)与普通型或重型症状病人相当(GMT 1:199.5，95% CI，141.8-280.5)。然而，调整其他因素，症状更严重的病人往往有更高的抗体水平(β=0.4639，P=0.0227)。恢复期病人的GMT为1:212.7(95% CI，157.5-287.3)，显著高于住院病人(1:76.1，95% CI，33.5-172.9;P=0.0055)。详见表3和表4。

　　讨论

　　随着COVID-19在世界范围内的广泛传播，迫切需要研发针对COVID-19的特效药或疫苗。本研究分析了不同临床症状的病人在发病后不同时间的中和抗体水平，发现恢复期病人的中和抗体水平较高，且抗体水平的变化存在明显的个体差异。

　　在本研究中，无论处于疾病的哪个阶段，所有COVID-19病人都出现了活病毒感染后的典型抗体反应。在发病后第10天，血清阳性率已经达到100.0%，这表明即使是疾病早期的病人免疫水平也已经足够强。在发病后31-40天，GMT达到峰值，尽管GMT在发病后41-53天略有下降，但血清阳性率仍为100.0%。然而，与本研究不同的是，其他研究表明抗体滴度在发病后10-15天达到峰值[12]。在调整其他因素后，多因素GEE分析表明，发病后31-40天的抗体水平与41-53天相当。然而，抗体滴度大于等于1:512的比例从31-40天的52.8%下降到41-53天的27.6%。由于缺乏发病后更长时间的血液样本，血清阳性率是否下降以及何时下降仍不清楚。病人的免疫力能维持多久是研发安全有效的抗病毒药物和疫苗的一个关键问题[13]。对于其他冠状病毒，感染后几个月的免疫力较强，随后开始减弱[14]。Chang等[15]指出，所有SARS-CoV病人的IgG滴度峰值均出现在发病后1-3个月，IgG滴度在发病后1-6个月期间明显下降(平均下降4.4倍)。这些研究提示，COVID-19病人恢复较长时间后的抗体水平值得进一步研究。

　　值得注意的是，在发病25天后，8例代表性病例中，4例中和抗体滴度继续上升，1例仍维持在较低水平，而其他3例则开始下降。此外，在发病后41-53天，尽管大多数病人的抗体滴度处于中等水平，仍有6.9%(2/29)的病人抗体滴度低于1:64。这些病人是否有再次感染SARS-CoV-2的风险尚不清楚，需要进一步探索。这些结果支持了关于抗体水平具有个体特异性的推测，在COVID-19的诊断和治疗中应予以重视。有必要针对更多的研究对象开展研究，以探讨抗体水平变化的个体特异性。

　　在比较不同性别、年龄和临床分型的抗体水平时，对于同一个病人多个时间点测定的抗体滴度，我们使用其几何均值来代表检测值，因此表3中的GMT只能用来提示抗体水平的高低水平。不同性别间的抗体水平相近，中和抗体滴度随着年龄的增长而显著上升。Wu等[12]还发现，中年和老年COVID-19病人的血清抗体滴度明显高于青年病人。这可能是由于老年病人对SARS-CoV-2有较强的免疫反应。高抗体水平能否防止这些病人的病情恶化发展成重型或者危重型，还需要进一步研究。

　　研究结果表明，恢复期病人的抗体水平高于住院病人，这可能是由于病情是否恢复与发病天数之间呈正相关(Spearman相关系数=0.5426，P<0.0001)。此外，研究还发现无症状或轻型症状病人的抗体水平略低于普通型或重型症状病人，这与已有的研究结果相符[16-17]。Zhang等[17]也得出了类似的结论，与IgG水平较低的COVID-19病人相比，症状严重病例在高IgG水平病人中更常见。另外，研究发现症状更严重的SARS-CoV病人具有更强的血清学反应，包括较高的血清转化率和IgG水平[18-19]。因此，随着疾病严重程度的增加，SARS-CoV-2抗体也随之增加。

　　本研究具有一定的局限性。首先，采用方便抽样的方法获得研究病例，而不是随机抽样，因此代表性相对不足，样本只能在一定程度上代表总体情况。其次，在70例病人中，仅有12例病人随访2次以上，平均随访时间较短(14.3天，范围为3.0-36.0天)。因此，有必要进一步对病人进行更长时间的随访。第三，病人症状以轻型和普通型为主，仅有1例无症状病人和4例重型病人。因此，在未来的研究中，无症状感染者和危重型病人的抗体水平需要进一步评估。

　　综上，即使在疾病的早期阶段，所有COVID-19病人对SARS-CoV-2均呈阳性反应，并且在恢复期病人中观察到明显的中和抗体反应。随着发病天数的增加、年龄的增大和疾病严重程度的增加，中和抗体水平增加。中和抗体水平的变化因人而异，存在个体差异。

　　利益声明

　　作者保证没有潜在的利益冲突。

　　贡献

　　概念与设计：冯英梅，王全意。数据的获取、分析或解释：所有作者。原稿撰写：王小莉，郭向华，辛倩倩。审稿：冯英梅，王全意。实验室检测：李晶。数据管理与统计分析：初艳慧，潘阳。

　　致谢

　　我们感谢所有当地的卫生工作者和疾病预防控制中心的专业人员为实地调查所做的贡献。

　　基金项目

　　本研究由国家重点研发计划(2020YFC0842100)、北京市科技计划(Z201100005420006)、北京市中医药科技发展计划(#BJYAYY-2020YC-02)资助。

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